1 材料
航天诱变凤仙花种子（SP4）由西华师范大学生命科学学院汤泽生教授提供。供试菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌（Escherichia coli）由实验室保存；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）购自于中国科学院微生物研究所菌种保存中心，绿脓杆菌（ginosa）由四川省绵阳市第三人民医院呼吸科提供。
2 方法
2.1 粗提物的收集及抑菌作用称取适量航天诱变凤仙花干种子，磨成粉末，采用磷酸缓冲液于4℃冰箱浸提24 h后离心取上清液。沉淀反复浸提数次，合并上清液，于4℃采用硫酸铵（80%饱和度）盐析收集沉淀的蛋白质，并透析脱盐，获得种子总蛋白质。将种子总蛋白溶液用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌做抑菌实验。
2.2 抗菌肽的初步纯化采用Millipore小型切向流超滤系统对脱盐后的蛋白质进行初步分离，选用使用截留量为50 KD，10 KD和5 KD的膜包经过3次分级分离，获得了抗菌肽粗提物。将上述各提取物上样C18柱，以99.9%乙腈和0.1%三氟乙酸TFA为洗脱液，以3.0 ml·min-1的流速进行洗脱，紫外检测仪器检测其OD210处的吸光值。收集具有抑菌活性的样品冷冻真空干燥至粉末，－20℃保存。同时参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的Tricine-SDS-PAGE电泳系统检测每步产品的分子量并进行抑菌试验。
2.3 抗菌肽的纯化用0.2 μm的一次性滤头对超滤分离出来的分子量小于5 KD的小分子蛋白质样品进行过滤，除去不溶性杂质。再采用安捷伦C18制备柱进行抗菌肽的纯化，流动相99.9%乙腈与0.1%三氟乙酸TFA，流速3.0 ml·min-1，柱温23℃。用紫外检测器在波长为210 nm下测紫外吸收值。收集各峰，冷冻真空干燥至粉末。将冻干品稀释后做抑菌试验，有抑菌活性的峰就含有抗菌肽。
2.4 抗菌肽抑菌活性的测定采用纸片法来进行抑菌活性检测。细菌培养基为LB固体培养基。菌种为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。在直径为10 cm的平皿内倾倒培养基；待平板冷却，吸取调整好浓度的，处于对数生长期的供试菌悬液100 μl于平板上，用无菌涂布器均匀涂布于平板表面。每种供试菌涂布两个平板，每个平板贴4张直径为6 mm的无菌纸片，其中两片加滴加20 μl抗菌肽样品，另外两片滴加无菌水作对照。在37℃培养24 h（绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为24℃），测量各抑菌圈直径，以表示抗菌活性。
2.5 抗菌肽的电泳检测以分子量73，50，35，25，16，8，2 kDa蛋白质为标准蛋白。因此本课题组参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的Tricine-SDS-PAGE电泳系统，对提取的小分子多肽的分子量进行检测。
3 结果
3.1 蛋白质粗提结果由图1可以看出，蛋白质粗提物中含有多种蛋白质，其中在29 KD附近存在有染色较深的条带，说明粗提物中含有小分子蛋白质，且含量较高。图1中条带2～5是第1次超滤，用50 KD的膜包截留得到的分子量小于50 KD的蛋白质。
3.2 抗菌肽超滤初步纯化结果经过超滤对种子总蛋白质进行初步分离，得到的分子量小于5 KD的小分子蛋白质样品进行电泳检测，分别用考马斯亮蓝和硝酸银染色法对凝胶进行染色，在2 KD左右都可以清楚的看到一条清晰的小分子蛋白质条带，在图上还出现了8 KD以上的'蛋白质条带，这是由于5 KD超滤膜在截留的过程中，在压力的作用下，5 KD的膜包可以通过3倍分子量以上的蛋白质。
3.3 抗菌肽纯化结果对超滤得到的小分子蛋白质采用高效液相再进行分离纯化。
①首先采用C18制备柱来分离分子量小于5 KD的蛋白质，根据峰的情况，分段搜集分离出来的物质，冻干，溶于无菌蒸馏水中。经过Tricine-SDS-PAGE电泳和抑菌活性鉴定后发现，搜集的a-b段在2 KD左右有条带，也具有抑菌活性。由于超滤分离出来的小分子蛋白质杂质太多，需要进一步纯化a-b段物质。
②按照高效液相第1次制备的方法对搜集的a-b段进行再纯化，结果见图2，可知第2次分离制备的蛋白质相对较纯，杂质含量少。搜集主峰，然后进行电泳及抑菌活性检测，检测发现主峰分子量在2KD左右，且具有抑菌活性。抑菌活性检测结果与分析抑菌实验结果见表1。结果表明，从航天诱变凤仙花种子中提取出的低分子量蛋白质对金黄色葡萄杆菌、绿脓杆菌有明显的抑菌作用，且抑菌作用持续时间较长；分别观察48 h和72 h后，抑菌圈没有被感染。对大肠杆菌抑菌效果不太明显，抑菌圈较小，对枯草芽孢杆菌几乎没有抑菌作用。
